El proceso se puede dividir en 3 fases: iniciación, elongación y terminación.
Iniciación
Para que pueda formarse la horquilla de replicación es necesario que las dos cadenas se separen para sintetizar el cebador y el ADN de la cadena de nueva síntesis. Para ello el ADN debe desenrollarse y el punto de partida viene determinado por una secuencia específica de nucleótidos conocida como origen de replicación; en E. coli, el origen de replicación se conoce como oriC. Esta secuencia contiene gran cantidad de adenina y timina, lo que facilita la separación de las cadenas, y es reconocida por proteínas iniciadoras que controlan este proceso, de forma que una vez unidas las proteínas iniciadoras al ADN provocan el desenrollamiento de estas regiones de fácil desnaturalización.
A continuación las proteínas iniciadoras reclutan el resto de proteínas que conforman el replisoma y que son necesarias para la síntesis de ARN y ADN, empezando por la helicasa (o topoisomerasa II). Esta enzima, generalmente con forma de anillo y de alta procesividad, se une a la región de ADN monocatenario resultante del desenrollamiento, desplazándose a lo largo del ADN mediante consumo de ATP en dirección a la horquilla de replicación, es decir, en dirección 5' → 3' en la hebra rezagada y 3' → 5' en la hebra adelantada, rompiendo los puentes de hidrógeno que mantienen unida la doble hélice. El siguiente conjunto de proteínas reclutadas son las denominadas proteínas SSB (single-stranded DNA binding proteins, proteínas ligantes de DNA monocatenario) encargadas de la estabilización del ADN monocatenario generado por la acción de las helicasas, impidiendo así que el ADN se renaturalice o forme de nuevo la doble hélice, de manera que pueda servir de molde. Estas proteínas se unen de forma cooperativa, por lo que su unión al DNA conforme avanza la helicasa es rápida. Por otro lado, conforme las helicasas van avanzando se van generando superenrollamientos en la doble cadena de ADN por delante de la horquilla y si éstos no fueran eliminados, llegado a un punto lel replisoma ya no podría seguir avanzando. Las topoisomerasas son las enzimas encargadas de eliminar los superenrollamientos cortando una o las dos cadenas de ADN y pasándolas a través de la rotura realizada, sellando a continuación la brecha.
Elongación
En el siguiente paso, la holoenzima ADN Pol III cataliza la síntesis de las nuevas cadenas añadiendo nucleótidos sobre el molde. Esta síntesis se da bidireccionalmente desde cada origen, con dos horquillas de replicación que avanzan en sentido opuesto. Cuando el avance de dos horquillas adyacentes las lleva a encontrarse, es decir, cuando dos burbujas se tocan, se fusionan, y cuando todas se han fusionado todo el cromosoma ha quedado replicado.
Puesto que la holoenzima ADN Pol III necesita de un extremo 3'-OH libre, es necesario que una ARN primasa catalice la formación de un fragmento corto específico de ARN llamado cebador, que determinará el punto por donde la ADN polimerasa comienza a añadir nucleótidos. Así, durante la síntesis, en cada horquilla de replicación se van formando dos copias nuevas a partir del cebador sintetizado en cada una de las dos hebras de ADN que se separaron en la fase de iniciación, pero debido a la unidireccionalidad de la actividad polimerasa de la ADN Pol III, que sólo es capaz de sintetizar en sentido 5´ → 3', la replicación sólo puede ser continua en la hebra adelantada; en la hebra rezagada es discontinua, dando lugar a los fragmentos de Okazaki).
La mitad del dímero de la holoenzima ADN Pol III sintetiza la hebra adelantada y la otra mitad la hebra rezagada.
En la hebra rezagada, cuando la ADN Pol III hace contacto con el extremo de otro fragmento de Okazaki contiguo, el cebador de ARN de éste es eliminado y los dos fragmentos de Okazaki de ADN recién sintetizado son unidos. Una vez se han juntado todos se completa la doble hélice de ADN. La eliminación de cebadores también se da en la hebra conductora, de síntesis continua, pero debido a que en ésta hay un solo cebador es un proceso que sólo tiene lugar una vez, mientras que en la hebra rezagada se dará tantas veces como fragmentos de Okazaki haya. Para ello intervienen una serie de enzimas: la enzima RNasa H ("H" de híbrido ARN-ADN) elimina el cebador a excepción del ribonucleótido directamente unido al ADN; la ADN Pol I elimina este ribonucleótido gracias a su actividad exonucleasa 5' → 3' y rellena el hueco con ADN quedando una molécula completa a excepción de una rotura (o "mella") entre el extremo 3'-OH libre y el fosfato 5' de la cadena reparada; por último, la ADN ligasa sella esa rotura catalizando la reacción de condensación entre el grupo fosfato y el OH de la desoxirribosa del nucleótido contiguo, completando el enlace fosfodiéster; para ello, es preciso hidrolizar una molécula de ATP.
Terminación
Al finalizar la síntesis de ARNm, esta molécula ya se ha separado completamente del ADN (que recupera su forma original) y también de la ARN polimerasa, terminando la transcripción. La terminación es otra etapa distinta de la transcripción, porque justo cuando el complejo de transcripción se ha ensamblado activamente debe desensamblarse una vez que la elongación se ha completado. La terminación está señalizada por la información contenida en sitios de la secuencia del ADN que se está transcribiendo, por lo que la ARN polimerasa se detiene al transcribir algunas secuencias especiales del ADN. Estas secuencias son ricas en guanina y citosina, situadadas en el extremo de los genes, seguidas de secuencias ricas en timina, formando secuencias palindrómicas, que cuando se transcriben el ARN recién sintetizado adopta una estructura en horquilla que desestabiliza el complejo ARN-ADN, obligando a separarse de la ARN polimerasa, renaturalizándose la burbuja de transcripción. Algunas secuencias de ADN carecen de la secuencia de terminación, sino que poseen otra secuencia a la que se unen una serie de proteínas reguladoras específicas de la terminación de la transcripción como rho .
